截至目前已經(jīng)有5款雙特異抗體獲批上市，Catumaxomab（CD3/EpCAM,已經(jīng)退市），Blinatumomab（CD3/CD19）、Emicizumab(FIX/FX)，強(qiáng)生的amivantamab-vmjw（EGFR/cMET）和羅氏最近獲批的Faricimab(Ang2/VEGF)。這些雙特異抗體的成功極大的刺激了雙特異抗體的發(fā)展，目前在國(guó)內(nèi)也已經(jīng)有多家企業(yè)具有原創(chuàng)的雙特異抗體平臺(tái)，并且已經(jīng)有超過(guò)100款雙抗在國(guó)內(nèi)申報(bào)臨床，可以說(shuō)雙抗的發(fā)展已經(jīng)逐步進(jìn)入高潮。但是隨著技術(shù)的進(jìn)步，機(jī)制的探索，目前三抗技術(shù)已經(jīng)悄然出現(xiàn)。與雙抗的雙靶點(diǎn)相比，三抗使得抗體的組合更加豐富多樣，也為抗體藥藥物的發(fā)展提供了更多的空間。本篇文章我們介紹一些三抗的構(gòu)建技術(shù)及平臺(tái)。

Merck三抗或者多抗平臺(tái)

近日，merck及其合作者在MABS上發(fā)表了其三抗或者多特異抗體構(gòu)建技術(shù)，其以防止重鏈錯(cuò)配的CEED技術(shù)為核心，搭配cFAE(Fab arm exchange，Genmab的體外雙抗重組技術(shù)，在兩個(gè)鏈重鏈上分別進(jìn)行 F405L 和K409R突變，在體外通過(guò)還原氧化條件進(jìn)行雙抗組裝)技術(shù)，同時(shí)在抗體的C末端進(jìn)行其它靶點(diǎn)抗體的融合。

羅氏的三抗平臺(tái)

羅氏目前已經(jīng)發(fā)表三種具有潛力構(gòu)建三抗的平臺(tái)技術(shù)，其中最Contorsbody平臺(tái)，該技術(shù)利用抗體的VH和VL替換CH2結(jié)構(gòu)域，搭配Knob-In-Hole技術(shù)，可以構(gòu)建結(jié)合三個(gè)不同靶點(diǎn)的TriFab-Contorsbody。

同樣以此技術(shù)為核心，其最近還設(shè)計(jì)了能夠在腫瘤中進(jìn)行富集激活的PACE（Prodrug-Activating Chain Exchange）平臺(tái)，該平臺(tái)利用了前藥的概念，可以使得抗體在腫瘤細(xì)胞表面富集，并通過(guò)鏈的交換形成有功能的抗體，從而在避免相關(guān)副作用的前提下，使抗體發(fā)揮藥效。

Zymeworks的ProTECT

ProTECT^TM為Zymeworks的新一代多特異抗體平臺(tái)，是在雙特異抗體的基礎(chǔ)上，融合了可以激活免疫系統(tǒng)的相關(guān)供體/配體蛋白，如PD-1/PD-L1，CTLA-4/CD80, CD28/CD80, PDL-1/CD80, ICOS/ICOSL,CD47/SIRPa等，該技術(shù)中的部分融合蛋白在腫瘤微環(huán)境中可以被腫瘤組織中的特異酶進(jìn)行切割，從而暴露其它抗原的結(jié)合位點(diǎn)，如CD3的結(jié)合位點(diǎn)等，使得抗體能夠激活T細(xì)胞發(fā)揮相關(guān)作用。

賽諾菲三抗

賽諾菲的三抗是以CODV-Ig平臺(tái)為核心進(jìn)行構(gòu)建，目前NIH和賽諾菲聯(lián)合開發(fā)的SAR441236的三抗應(yīng)該是最早進(jìn)入臨床的三抗，該抗體結(jié)構(gòu)如下圖所示，其中融合三種廣譜中和抗體：VRC01， PGDM1400和10E8v4，三者別與病毒的CD4bs，V1V2多糖位和MPER結(jié)合，目前該抗體已近位于Ⅰ期臨床。除此之外，三諾菲利用還開發(fā)了CD28/CD3/CD38的抗腫瘤三抗SAR442257，同樣也已經(jīng)進(jìn)入臨床。

GT-Biopharma的TriKE平臺(tái)

TriKE平臺(tái)是以激活NK細(xì)胞為核心進(jìn)行構(gòu)建，其利用靶向CD16的納米抗體結(jié)合并激活NK細(xì)胞，結(jié)合腫瘤抗原的納米抗體結(jié)合腫瘤細(xì)胞并將腫瘤細(xì)胞和NK細(xì)胞進(jìn)行橋接，利用NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，在此基礎(chǔ)上，融合了能夠刺激NK細(xì)胞進(jìn)行活化擴(kuò)增的IL-15

Innate Pharma的NKCE平臺(tái)

NKCE平臺(tái)同樣以激活NK細(xì)胞為核心，不同的是其靶向NKp46激活NK細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上該平臺(tái)同時(shí)融合了FC（可以結(jié)合CD16并激活NK細(xì)胞，同時(shí)其還可以延長(zhǎng)抗體的半衰期），和IL-2v（促進(jìn)NK細(xì)胞的增值）

Revitope的TEACs技術(shù)平臺(tái)

TEACs技術(shù)是由Revitope開發(fā)的在腫瘤微環(huán)境中特異性激活的抗體平臺(tái)，

其設(shè)計(jì)如下圖所示，結(jié)合CD3的抗體被一分為二，并利用多肽鏈進(jìn)行結(jié)合以增加抗體的穩(wěn)定性，在腫瘤微環(huán)境中，結(jié)合CD3的VH和VL被暴露并相互配對(duì)，形成具有功能的CD3，在結(jié)合腫瘤抗體的橋接下，利用T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。

Molecular Partners的DARP技術(shù)平臺(tái)
 

確切的講DARP技術(shù)并不是真正意義上的抗體，其核心結(jié)構(gòu)為DARPins蛋白，DARPins是人體基因組表達(dá)最豐富的結(jié)合蛋白之一，與其它重復(fù)蛋白類似，其含有由不同數(shù)目重復(fù)序列構(gòu)成重復(fù)蛋白結(jié)構(gòu)域，其主要功能是與靶蛋白結(jié)合，從而導(dǎo)致不同作用模式，如酶抑制劑，蛋白之間的錨定等。DARPins其除了含有重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域外，還有N端的帽子和C端的帽子，主要用來(lái)穩(wěn)定重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域。其中間的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域的數(shù)量可以變化，一般為4-6個(gè)，因此其分子量大小為14-21KDa，較小的分子量使得其可以串聯(lián)多個(gè)不同功能的DARPins，并進(jìn)行相關(guān)治療。

基于mAb2的三抗

近期有研究者依據(jù)F-star的mAb²平臺(tái)并搭配cFAE(Fab arm exchange)技術(shù)構(gòu)建了能夠結(jié)合三個(gè)不同抗原的三特異抗體。該技術(shù)對(duì)抗體的CH3的末端進(jìn)行修飾改造，使其可以結(jié)合抗原，并進(jìn)行 F405L 和K409R突變方便后期在體外進(jìn)行抗體組裝。

Merus的Triclonics平臺(tái)

Triclonics平臺(tái)是在Biclonics®雙抗平臺(tái)上的改進(jìn)，該平臺(tái)結(jié)合靶點(diǎn)的形式可以是2+1或者是1+1+1。與雙特異抗體平臺(tái)相似，該平臺(tái)同樣采用了共同輕鏈防止重鏈與輕鏈的錯(cuò)配；為了防止重鏈錯(cuò)配，采用了DEKK突變。

Mcrogenics的TRIDENT平臺(tái)

TRIDENT是在DART雙特異抗體平臺(tái)上的改進(jìn)和發(fā)展，其在DART的基礎(chǔ)上加入了抗體的Fc從而可以增加抗體的半衰期，另外，其同時(shí)加入正?？贵w的Fab，因此該抗體平臺(tái)可以根據(jù)需要進(jìn)行多種調(diào)整，既可以形成2+1的雙特異抗體，也可以形成1+1+1型的三特異抗體。

恩沐生物的三抗平臺(tái)

恩沐生物雙/多特異抗體的構(gòu)建策略是利用兩個(gè)抗體可變區(qū)對(duì)其中一個(gè)Fab替換，如下圖（左）所示，其中H1和L1為第一個(gè)抗體的VH和VL，H2和L2為第二個(gè)抗體的VH和VL，為了增加抗體VH和VL的正確配對(duì)，在H2和L2上進(jìn)行二硫鍵突變和正負(fù)電荷氨基酸突變。

該雙/多特異抗體抗體平臺(tái)在大小上和常規(guī)IgG抗體相差不大，但是可以形成2+1或者1+1+1型的多價(jià)抗體（下圖右，右側(cè)為正常的Fab）。

百利藥業(yè)多抗

百利藥業(yè)的四特異抗體平臺(tái)是以完整的IgG抗體為基礎(chǔ)，然后在抗體的N末端和C末端融合響應(yīng)的scFv，該抗體平臺(tái)從分子量上來(lái)看是目前雙抗平臺(tái)中最大的一個(gè)，而且抗體中含有多個(gè)scFv，因此后期工藝的開發(fā)可能也比較具有挑戰(zhàn)。

總結(jié)

三特異抗體或者多特異抗體是在雙特異抗體基礎(chǔ)上的發(fā)展，因此對(duì)于具有雙特異抗體的平臺(tái)（特別是具有Fc的雙抗平臺(tái)）的企業(yè)，其后期的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)相對(duì)比較容易，因?yàn)槿禺惪贵w可以在雙特異抗體的基礎(chǔ)上融合VHH，scFv或者Fab。三特異抗體在作用機(jī)制上的設(shè)計(jì)可能比雙抗要更難，因?yàn)樾枰嗟目紤]不同靶點(diǎn)的協(xié)同，不同靶點(diǎn)的在抗體上的位置等等。