基于先進的質(zhì)譜和色譜平臺，華大蛋白提供了如下生物藥表征分析服務：

1）精確分子量測定

2）一級序列確證

序列覆蓋度/肽譜分析

N端及C端序列確證

3）修飾譜分析

4）糖基化修飾分析

糖基化位點及糖型分析

寡糖譜分析

5）二硫鍵分析

6）ADC藥物偶聯(lián)位點分析

7）電荷異質(zhì)性分析

8）聚體和片段含量分析

9）唾液酸含量分析

10）宿主殘留蛋白鑒定及定量

11）氨基酸含量分析

12）藥物靶點確認

 

生物藥表征分析的必要性：

確保生物藥的穩(wěn)定性、藥效、藥代動力學、用藥安全性

 

 

 

詳細內(nèi)容：

1）精確分子量測定

采用高精度質(zhì)譜可獲得生物藥的精確分子量，質(zhì)量誤差可在 1Da 之內(nèi)。根據(jù)這一基本質(zhì)量 屬性，一方面可以判斷生物藥一級序列結構的正確性，另一方面可以獲得生物藥分子上可能存 在的主要修飾形式。

 

2）一級序列確證

序列覆蓋度/肽譜分析

肽譜分析是對生物藥品一級結構進行確證的金標準。涉及的檢測方式有兩種，一種是使用質(zhì)譜 (MS) 鑒定序列，一種是使用紫外(UV)檢測比較樣品譜圖與參比譜圖的一致性。

 

N端及C端序列確證

抗體或重組蛋白由于N末端信號肽序列加工不完全，易發(fā)生末端甲硫氨酸殘基變異、焦谷氨酸環(huán)化修飾等。C末端則常見序列截短，如單克隆抗體重鏈C末端Lys殘基缺失。因此，需對產(chǎn)品的末端氨基酸序列進行分析，以鑒別蛋白質(zhì)的氨基端、羧基端的性質(zhì)及其均一性。

3）修飾譜分析

翻譯后修飾是各類重組蛋白、抗體中普遍存在的現(xiàn)象，會帶來產(chǎn)品的異質(zhì)性并影響質(zhì)量。ICH-Q6B指南要求應對生物藥的脫酰胺、磷酸化、糖基化、氧化等修飾形式進行分析，制定驗收質(zhì)量標準。高精度質(zhì)譜結合專業(yè)的解析軟件，可對蛋白質(zhì)上存在的翻譯后修飾種類及其占比進行分析。

4）糖基化修飾分析

同其他修飾不同，糖基化修飾具有極高的異質(zhì)性，是蛋白質(zhì)結構異質(zhì)性的重要因素。糖鏈的結構在補體激活和受體親和性上發(fā)揮著至關重要的作用，因而，糖基化修飾又是影響治療性抗體有效性的關鍵屬性。此外，非人類來源的糖型可能會引發(fā)免疫反應，而帶來安全性問題。因此，糖基化修飾分析是表征治療性糖蛋白（尤其是單抗）的重要部分。ICH-Q6B指南提出，需對糖蛋白的糖基化位點、糖鏈結構（糖型）及含量進行明確。

糖基化修飾較為復雜，對分析技術的要求較高，只有具備有效的富集手段、高精度LC-MS/MS及專業(yè)的數(shù)據(jù)解析軟件，方能對糖基化進行有效的表征。

 

糖基化位點及糖型分析

在藥物篩選階段，可以通過糖肽分析，同時獲得糖基化修飾位點、糖鏈類型及各糖型的相對豐度信息，簡便快捷，流程如下：

糖蛋白酶解 ®糖肽富集®LC-MS/MS分析®數(shù)據(jù)解析

 

寡糖譜分析

一般采用pNGaseF酶將糖鏈從糖蛋白上酶解下來，并將糖鏈用2-AB試劑進行衍生化標記，之后一方面采用高精度質(zhì)譜對糖鏈類型進行鑒定，另一方面可通過熒光信號對糖鏈進行定量分析。在放行階段，可僅采用熒光色譜對糖譜進行定量分析。

5）二硫鍵分析

二硫鍵分析可用于生物藥的結構分析，協(xié)助完成分子設計、性質(zhì)改良和工藝研究。非還原條件下的肽譜數(shù)據(jù)，結合專業(yè)軟件進行數(shù)據(jù)解析，可獲得二硫鍵定位信息。

6）ADC藥物偶聯(lián)位點分析

對于ADC藥物而言，對藥物在抗體上的偶聯(lián)位點及其偶聯(lián)比例進行表征是進行質(zhì)量控制的關鍵步驟。通過高精度質(zhì)譜技術可同時獲得偶聯(lián)位點及其比例，并可根據(jù)比例計算DAR值。

7）電荷異質(zhì)性分析

蛋白質(zhì)所帶有的翻譯后修飾會引起表面電荷改變，產(chǎn)生電荷異質(zhì)性，進而影響藥物的親和力等。通過等電聚焦凝膠電泳(IEF)、毛細管等電聚焦凝膠電泳(cIEF)、陽離子交換色譜法(CEX)和陰離子交換色譜法(AEX)可以對抗體主峰和酸（堿）性變異體進行分析。

8）聚體和片段含量分析

蛋白質(zhì)構象波動或局部結構微變可能會導致蛋白質(zhì)中具有聚集傾向的序列或“熱點(hot spot)”暴露，進而形成二聚體和/或寡聚體。在生物藥開發(fā)過程中以及在整個生產(chǎn)中均應對電荷異構體進行鑒定和監(jiān)測。利用分子排阻色譜法（SEC-HPLC）可對單體和多聚體分子進行分離及含量分析。

9）唾液酸含量分析

唾液酸對于維持糖蛋白的穩(wěn)定性和空間構象具有重要作用，抗體藥物的N-聚糖和O-聚糖上的唾液酸主要為N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）和N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Gc)，因人體不能合成 Neu5Gc，故其具有一定的免疫原性。為確保藥物的安全和效用，保持批次間質(zhì)控的一致性，ICH Q6B規(guī)定了在工藝開發(fā)、制造純化、劑型開發(fā)和穩(wěn)定性測試等過程中需監(jiān)測唾液酸結構與相對含量。檢測時首先對蛋白質(zhì)上的唾液酸酸解，之后利用三重四極桿質(zhì)譜LC-MS/MS（QTRAP4500）檢測，根據(jù)標準曲線對唾液酸含量進行準確定量。

10）宿主殘留蛋白鑒定及定量

美國藥典已經(jīng)明確，需采用LC-MS/MS技術對生物藥宿主殘留蛋白進行鑒定及定量，建立這類雜質(zhì)控制的質(zhì)量標準。不同批次原液及產(chǎn)品均應進行宿主殘留蛋白的分析。由于宿主殘留蛋白含量低，其分析受到藥物主成分的影響，因此如何對其進行較為全面的鑒定和定量，需要在技術方法上進行考量。

11）氨基酸含量分析

將蛋白質(zhì)或多肽酸水解后進行衍生化及HPLC分析。

12）藥物靶點確認

蛋白質(zhì)芯片是進行藥物靶點分析的有力工具。運用獨一無二的人兩萬點蛋白質(zhì)芯片與目標藥物孵育，之后用熒光標記的特異抗體、親和素等方式進行顯色，即可對藥物的作用靶點進行確認。